Перед вами Римская Империя пятнадцатого века, раздираемая политическими интригами, внутренними междоусобицами и нескончаемой войной между тамплиерами и ассасинами, главой последних является никто иной, как Эцио Аудиторе да Фиренце. Достигнув высшей ступени в иерархии ордена, итальянец решает раз и навсегда покончить с противниками братства после того, как Монтериджони была разрушена и опустошена наемниками, посланными Борджиа. Эцио немедля спешит в Рим, ведь Чезаре Борджиа, руководивший атакой на виллу, сейчас находится именно там.
Однако Братство больше не имеет той влиятельности, которую имело раньше: тамплиеры спокойно руководят ситуацией и буквально рушат Рим на глазах у всех, на улицах царит полная анархия, а помешать этому никто не может.
Взяв ситуацию под свой контроль, Эцио решает возродить древний орден, организовывая свое "подпольное" убежище, куда начинают стекаться молодые рекруты и уже умудренные опытом ассасины, не осмеливавшиеся до сих пор заявить о себе. Никколо Макиавелли, передавший титул лидера Эцио, оставляет свой пост, возложив все надежды на итальянца, в чьих руках теперь судьба всего Братства.
Тем временем Дезмонд, Люси, Шон и Ребекка все глубже залезают в воспоминания об Эцио, чтобы узнать местонахождение Яблока Эдема и остановить надвигающуюся катастрофу.